肌肉发达的「基因敲除狗」是怎么造出来的？

2015-10-29 14:30:10 | 来源：玩转帮会 | 投稿：佚名 | 编辑：小柯

原标题：肌肉发达的「基因敲除狗」是怎么造出来的？

出品：科普中国

制作：基因组所多米诺基因科普协会管晓楠

监制：中国科学院计算机网络信息中心

近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。

科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定 DNA 片段的敲除、加入等。而 CRISPR/Cas9 技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

一、与诺奖“擦肩而过”的 CRISPR/Cas9 技术

这不是 CRISPR/Cas9 这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015 年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗?杜德娜和艾曼纽?夏邦杰。二人更是获得了 2015 年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。

那 CRISPR/Cas9 到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近 700 篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？

CRISPR/Cas9 是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。

二、CRISPR/Cas 系统的灵感来源

CRISPR/Cas9 技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的 CRISPR/Cas 系统实现的。

在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为 CRISPR 序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。

1.“记录”入侵者档案

其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段 DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图 A 所示）。

图 1 CRISPR 序列示意图
其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列

病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为 PAM（Protospacer adjacent motifs- 原间隔序列临近基序）。

当病毒或外源质粒 DNA 首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源 DNA 潜在的 PAM 序列进行扫描识别，将临近 PAM 的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上 CRISPR 序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。

2、打击二次入侵者

当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导 CRISPR 序列的表达。同时，在 CRISPR 序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为 Cas 基因。CRISPR 序列的转录产物 CRISPR RNA 和 Cas 基因的表达产物等一起合作，通过对 PAM 序列的识别，以及“间隔序列”与外源 DNA 的碱基互补配对，来找到外源 DNA 上的靶序列，并对其切割，降解外源 DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。

正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9 技术应运而生，从而使科学家们利用 RNA 引导 Cas9 核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。

三、CRISPR/Cas9 技术的实现需要什么？

在 CRISPR/Cas9 技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组 DNA 看作病毒或外源 DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导 RNA（guide RNA, gRNA）和 Cas9 蛋白。

其中，向导 RNA 的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的 PAM 序列（即三碱基序列 NGG，其中 N 可以是任意碱基），而且向导 RNA 要与 PAM 上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图 3 所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导 RNA（向导 RNA1，向导 RNA2），将其与含有 Cas9 蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导 RNA 通过碱基互补配对可以靶向 PAM 附近的目标序列，Cas9 蛋白会使该基因上下游的 DNA 双链断裂。

对于 DNA 双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着 DNA 损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。

图 2 CRISPR/Cas9 技术敲除掉部分基因原理图（绘图肖媛）

而 DNA 片断的插入或定点突变的实现，只需在此基础上为细胞提供一个修复的模板质粒，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。

图 3 CRISPR/Cas9 技术插入新基因原理图（绘图肖媛）

当然，CRISPR/Cas9 技术的成功率并非百分之百。向导 RNA 靶向序列的非特异性，以及 DNA 损伤修复的不确定性，都可能会导致基因组上其它位置产生未知的突变，也就是所谓的“脱靶”现象，这也是现阶段影响 CRISPR/Cas9 技术应用的瓶颈之一。但随着科研人员不断对 Cas9 蛋白的优化改造，对靶基因识别特异性的增强， CRISPR/Cas9 技术的“打靶”效率将不断提高。

四、CRISPR/Cas9 的前景如何？

CRISPR/Cas9 技术在医疗健康、生产生活、家畜育种等领域的应用，不断取得喜人的新成果。

如在医疗健康领域，用 iPS 细胞（诱导多能干细胞）治疗人类的镰刀形贫血症，可以将病人的皮肤细胞诱导成 iPS 细胞，利用 CRISPR/Cas9 技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因，再将修复的 iPS 细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内。此外，像使用 CRISPR 技术根除 HIV 病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果先后被 Nature 等著名杂志所报道。在奶制品的发酵中，利用 CRISPR/Cas9 增强发酵菌株对噬菌体的防御能力；在家畜育种方面，也正在利用基因编辑工具通过对显著影响家畜生产性能的基因位点进行改良，以实现猪、牛、羊等大型家畜生产性能的提高等。

但正如科学是把双刃剑，任何新技术的出现都少不了其反对者的存在，在 CRISPR/Cas9 技术得到热烈呼声的同时，不少人也对它提出了质疑，特别是对其脱靶事件可能导致基因组其他位置产生未知突变表示担忧。

作为生命科学领域的一项重大突破，笔者认为 CRISPR/Cas9 的创新性、技术性毋庸置疑，随着对 CRISPR 系统认识的加深，实验设计的优化改造，相信其打靶效率会进一步提高，CRISPR/Cas9 以及其衍生技术终究会带来一场科学史上的巨大变革。期待在不久的将来，CRISPR/Cas9 所带来的巨大转变必将能够惠泽万家，到时候属于它的诺奖终将到来。

参考文献：

[1]Doudna, J.A.; Charpentier, E., Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 2014, 346, (6213), 1258096.[图片来源]

[2]Fang, R.; Chang, F.; Sun, Z.-L.; Li, N.; Meng, Q.-Y., New Method of Genome Editing Derived From CRISPR/Cas9. Acta Agronomica Sinica, 2013, 40, (8), 691.

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