分子标记基因定位克隆转基因技术重要技术手段

2015-12-11 11:00:17 | 来源：新浪微博 | 投稿：ffallrain | 编辑：小柯

原标题：分子标记基因定位克隆转基因技术重要技术手段

分子育种:分子标记转基因的关系
说转基因三个字大家都知道,但是很少有人了解分子标记是什幺!那幺分子标记是什幺呢?基因就是分子!,分子标记也就是基因标记,基因标记起什幺作用??基因标记是分子育种中在指定基因段上标记选用遗传目的基因段定位, 比如抗虫基因,抗病基因,抗除草剂基因等等就是这样选择性定位,选择出来的基因,比如选育出老鼠基因,牛基因分子标记基因,然后再进行基因克隆复制,把需要的外源基因插入载体,转入受体获得表达转基因.同时在外源基因插入环状基因过程,需要进行分子标记定位把外源插入基因段. 分子标记是基因工程,转基因使用重要技术手段,所以转基因中一定是使用了分子标记,很多人认为分子标记与转基因没关系!只能说你是文科生了.
华中农业大学转基因猪专家熊远着发布的分子标记选育种猪,证明是使用了基因工程克隆技术并不是普通常规育种,分子标记选育外源让猪变瘦的基因通过载体转入猪胚胎,再通过普通育种,母猪子宫正常生长生育育种获得转基因瘦肉型种猪 ! 这就是普通育种分子标记选择育种,相关转基因猪原理请参考熊远着转基因猪讲座http://v.youku.com/v_show/id_XMjgxMzQxNTcy.html 预告片38分后熊远着说:美国管控转基因很严,不允许搞,他们就拿到中国来搞! 有些人说分子标记不是转基因是对的也是错的.分子标记是基因定位技术,转基因中一定使用了分子标记,你能说分子标记不是转基因吗? 与转基因没关系吗? 转基因猪是分子标记基因克隆外源完成的. 所以分子标记选育的猪是转基因猪也是正确. 说分子标记猪一定不是转基因是不正确的
下面是使用分子标记部分原理供参考,文科生请绕道!

分子标记：基因定位克隆

　　基因定位克隆（map-based cloning）是用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。
　　具体的步骤是先将目的基因，亦即目的基因的突变定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记；接着利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定的基因组片段克隆并分离出来；最后是根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。

　　成功地应用基因定位克隆技术分离目的基因的一个必要条件是，以酵母人工染色体YAC（yeast artificial chromosome）为载体构建含有大片段DNA的YAC库。另一个必要的条件是要有可用的同目的的基因紧密连锁的DNA探针。
　　下面就相关的一些问题作一简要的说明。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1） RFLP分子标记
　　所谓RFLP，即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸内切限制酶切割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。由于核酸内切限制酶是以一种序列特异的方式切割DNA分子，来自一个完整的纯合子个体（所有的基因及DNA序列）的每一种同源的DNA分子，都会在同样的位点被准确地切割。
　　从不同的生态型（ecotype）或不同的地理隔离群（geographicalisolate）植株分离的总DNA中，同源DNA分子通常会表现出序列的趋异性（divergence），形成RFLP（图6-11）

。这些RFLP是由于DNA序列上的特定变化（突变）引起的，因此它们也能够像其他任何遗传标记一样进行定位，成为一种十分有用的分子标记。
　（2） RFLP作图的原理与步骤
　　下面我们以拟南芥菜为例，简述RFLP作图的基本原理与步骤（图6-12）。

将实验的条件限定为：两个不同的拟南芥菜生态型，即Columbia生态型和Niederzenz生态型；两个杂交探针，即基因A和基因B；一种核酸内切限制酶EcoRI。
　　从这两个不同生态型的拟南芥菜提取的两份总DNA，经过EcoRI限制酶的切割和琼脂糖凝胶电泳分部分离之后，作Southern转移，并分别同放射性标记的探针基因A和基因B杂交。在图中可以看到，两亲本生态型的DNA，同两种探针杂交的结果都呈现出多态性现象，这说明在这两个生态型的不同大小的DNA限制片段上，都存在着基因A和基因B的序列。F1代是杂合子，正如我们预期的情况一样，它含有两亲本的限制片段。由这些F1代植株自花授粉所产生的F2代植株中，也会出现这种预期的1：2：1的分离模式。
　　这两个基因是独立分配还是连锁分配，会表现出非常不同的结果。在图6-19的例II中显示的基因A和基因B是完全连锁的。
　（3）染色体步移
　　应用染色体步移技术克隆目的基因的主要步骤概括于图6-13。

　　步移的起点克隆，具有一个与待分离的目的基因尽可能靠近的已经鉴定的分子标记。这种标记可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆，在本例中是一种RFLP标记克隆。
　　先构建起点RFLP标记克隆的限制图，并把其中最靠近目的基因的限制片段B-H亚克隆出来。此限制片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针，从基因组文库中筛选与起点克隆具有重叠序列的新克隆（称之为一步克隆）。重复进行上述的各个步骤：构建一步克隆的限制图，亚克隆其中最靠近目的基因的限制片段H-E，该片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针从基因组文库中筛选与一步克隆具有重复序列的新克隆（称之为二步克隆）。如此重复进行多次，每得到一个新的克隆都更接近目的基因一步，直至最后获得了目的基因的克隆。由于这种技术是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象地称之为染色体步移（chromosome walking）。
　（4）YAC库的构建
　　若用柯斯质粒作载体构建基因组文库，则需要相当大量的克隆载体，叫做酵母人工染色体（yeast artificialchromosome。YAC）。这种YAC载体可以克隆数百kb的大分子量的DNA片段。如图6-14所示，YAC载体包括如下的组成部分：
　　① 一段来自酵母染色体的着丝粒序列；
　　② 一段控制酵母DNA复制的自主复制序列（autonomously replicatimg sequence，ARS）；
　　③一对酵母的端粒序列，在有的YAC载体中（例如Pyac4），这对端粒序列来自四膜（Tetrahymena）染色体；
　　④选择记号；
　　⑤克隆位点。
　　YAC载体能够如同染色体一样在酵母细胞中正常地复制，并可以克隆大片段的外DNA，其大小至少可相当于最大的酵母染色体。
　　应用酵母人工染色体构建真核基因组YAC库的基本过程示于图6-14。

首先选用核酸内切限制酶EcoRI和BamHI对YAC载体pYAC4作双酶消化，结果两个端粒序列之间的片段便被移走，产生出具有EcoRI粘性末端的两条臂分子。在每一条臂分子中都带有一段端粒序列和一个选择记号。同时再选用一种切割位点稀少的核酸内切限制酶，对高分子量的真核基因组DNA作局部消化。反应物通过脉冲电场凝胶电泳或密度离心除去分子量小于200kb的DNA片段，收集剩余部分的大分子量的DNA片段，纯化后与YAC臂连接。或者是直接从电泳胶中切出含有所需分子量范围的DNA片段的胶块，从中提取DNA，并与YAC臂连接。然后再经过一次脉冲电场凝胶电泳，把含有插入序列的YAC载体分离出来，并转化给已经去掉了细胞壁的酵母细胞，即原生质球。应用存在于两臂分子上的选择基因（selecyable genes），筛选含有YAC两臂的酵母克隆。

原理上大家应该明白了.什幺是分子标记基因工程克隆转基因过程 ,

那幺华中农业大学转基因瘦肉猪流入市场了吗?

可以肯定的是流入市场了.请看证据!

分子育种的转基因瘦肉猪早就推广到湖北,湖南,广西,江西,福建十多个省市!,美国不允许搞转基因,转基因专家就在中国搞转基因种转基因养殖转基因?老百姓知情选择权呢?

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